trxtag标签作用

『壹』 从维密超模到专业运动员都在练的TRX，有多酷

许多人第一次听说它是通过明星、维密超模的社交账号，第一次练习它是为了燃脂、虐腹。这项早已登上IG热门Hashtag的训练到底是什么？能达到哪些训练目的？它到底有多酷？别急，现在就来告诉你。

明星和超模们热衷TRX，借助它 高效燃脂、塑形 ；而运动员们重视它的功能性，以 达成更精准的训练目标 。只需要一根TRX悬挂绳，随时随地就可以开练。

现在，TRX训练被列入更多健身者的日常，不仅是因为它title够酷，听说很好，更是因为它适合任何运动水平和阶段的人群，还可以不断变换出多种训练，值得大家持续练习。

TRX，也被称为悬挂训练系统。全称Total Resistance Exercise， TRX全身抗阻力训练。 源自美国海豹突击队，以“all core，all level”之名风靡健身界，着重身体核心区训练，全方位高强度调动核心肌群。

它并不是一套动作，而是一套训练系统。

将身体看作一个整体，藉由悬挂绳提供不稳定的核心训练，迫使练习者与自身重量抗衡，增加肌群的协调与稳定。

因此， 练习TRX可以强化核心，燃烧脂肪，雕塑线条，效果极佳。

TRX的训练动作，由七大基础动作模式转化而来。

而通过调节训练绳长度，配合不同训练动作，可以变换出上百种功能性训练方式，以最小投入，实现最大回报。

可以在任何地方，为任何体能水平练习者，达成任何训练目标。

我们选择一项运动，会看它能否有针对性的帮助练习者有效提升训练效果。TRX可以配合不同训练，而且它更安全、精准、高效。

练习时每次轻微的晃动，都会迫使核心肌群发力维持身体的稳定。每一个看似简单的动作，其实都需要强大的“硬核”支撑。看上去很简单？不如试着挑战看看。

友情提示各位新手玩家，开始尝试时请在专业指导下练习，正确掌握悬挂绳的使用方法和核心发力的感受后，再尝试灵活运用，进阶练习。

从维密超模到奥运冠军都在练习的TRX训练，同样适合任何体能水平的练习者，适用于包括减脂、塑形、强健体能、强化核心等在内的任何运动目标，TRX训练追求的是精准与稳定，更关注动作的完成质量，是值得学习与尝试的训练项目。

『贰』 蛋白的表达与纯化

蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了，没有LSS说的那么吓人。
说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧：

1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取

2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。（我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备），这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要

3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白

4 蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤：离心，取蛋白所在的相
如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95％的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS－标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。

5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。

我们实验室做出来的一个蛋白，编码序列GC含量高75达％，但是功夫不负有心人，只要你想做那件事情，积极的寻找解决问题的手段，总会搞定的，没有跨不过的坎。如果坎太宽，搭桥解决总行。

『叁』 重组蛋白的组氨酸标签 怎么去掉

6xHis标签可用一些酶，譬如TAGZyme去除

『肆』 如何阅读质粒图谱档 详细�0�3

一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位点：MCS 克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA 作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori 的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β -内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β 失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。一般来说，外源DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA 转录的DNA 顺序，这个DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA 分子上可以与RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核 l 基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD 序列。 l 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly （A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－ stream 有一段GT 或T 富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 P.S.基因工程所用的vector 实际上是DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的DNA 顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。 P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。 基因工程载体的3个特点： （一）都能独立自主的复制：载体DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如 MCS，插在其中的外源DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。 四、载体的选择和制备 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 1、 构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如小于10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意3点： ①选择合适的启动子及相应的受体菌； ②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位； ③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。选用质粒（最常用）做载体的4点要求： ①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒小于10个。 ③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； ④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切 割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 二、pET32a(+)自身载体表达的片段大小 The expected fusion protein expressed encoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 20.4 kDa. The Trx-tag by itself would contribute 12kDa. The rest is e to the two His-tags (0.8kDa each) and the S-tag (1.7kDa). The remaining 5.1kDa is e to the intervening（?） 54 amino acids between the tags and until the stop codon. 三、pET32系列载体的载体序列地址 四、pET 系列载体阅读方法 ori 是复制起始点，细的黑箭头是几个不同的转录区，其箭头方向不同，说明每个表达产物（如kan 抗性基因、LacI 等）都有独立的promoter，有时与T7 promoter 方向相反。粗的黑箭头是MCS，用于目的基因的插入，箭头方向表明目的基因的转录方向，它的转录方向可以与其它几个不同的转录区相同，也可以不同，如 Kan 抗性基因、LacI 的方向是一样的，可能与调控相关，不同的载体是不一样的。一个载体可只看它的启动子到终止子那一段，其它的可以考虑少些。 五、pET 表达菌株的相关信息 （ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。 AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。 BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。 BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。 HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。 NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。 Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。 Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。 详情可咨询生物淘

『伍』 用pET-32a表达含起始密码子的目的蛋白时，翻译是从载体上的起始密码子开始还是从目的蛋白上的开始

当然是从载体上已有的融合蛋白开始，你的目的蛋白是在Trx和His-tag后面的

『陆』 蛋白质融合标签

蛋白标签（Protein tag）技术是指利用基因克隆手段，将具有特定功能的多肽，蛋白质结构域，甚至完整蛋白质与目标蛋白融合在一起，以实现目标蛋白的表达纯化，检测和示踪等应用的技术。蛋白标签融合已经成为蛋白质研究中最常用的技术之一，下面我就为大家盘一盘这些常用标签的特点及应用。

蛋白标签根据其功能，大致可以分为检测标签、表达纯化标签和示踪标签三类。

蛋白质的检测方法包括质谱、酶活检测、免疫分析等，其中应用最为广泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要将目标蛋白作为抗原，注射动物，然后从免疫血清中分离抗体，根据抗原-抗体间的免疫反应进行特异性检测。这种方法最大的缺陷就是每更换一个目标蛋白就要制备一个对应的抗体，操作繁琐，成本昂贵。融合标签的使用，使蛋白质免疫分析走向通用化和便利化。我们将特定的标签与目标蛋白融合后，两者是共同表达的，通过检测融合标签，可以得到目标蛋白的表达情况。经过长期的研究，目前已经开发出一些比较成熟的检测标签，下面就挑几个来介绍一下：

1) HA

HA标签，属于小标签，共9个氨基酸，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，对目标蛋白的空间结构影响小, 可融合到N端或者C端，可购买商业化的Anti－HA抗体检测。HA标签常用于蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验，偶尔用于ELISA和ChIP分析。

2) His

His标签，也是小标签，多指6个组氨酸多肽，该标签对目标蛋白的空间结构影响极小, 可融合到N端或者C端，一般无需切除也不会对目标蛋白功能产生影响，可购买商业化的Anti－His抗体检测。His标签常用于蛋白质印迹实验。

3) c-Myc

Myc标签，包含人类原癌基因Myc的10个氨基酸区段，序列为EQKLISEEDL，可融合到目标蛋白N端或者C端。由于可获得高特异性抗Myc单克隆抗体，因此在Western印迹，免疫荧光和免疫沉淀实验中被广泛使用，但是很少用于蛋白质纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化c-Myc抗体。

4) Flag, 3×Flag

FLAG标签，是目标蛋白中一种比较流行的短肽标签，序列为DYKDDDDK，可以与蛋白质的C端或N端融合。由于其包含肠激酶的识别位点（DDDDK），可方便去除，因此比较适合融合在目标蛋白N端。Flag标签与同类标签相比，更具亲水性，因此通常不会变性或使与其连接的蛋白质失活，常用于真核表达系统中目标蛋白的检测。目前已经开发出性能更好的3×Flag 标签，共22个氨基酸，分子量2.7KDa。3×Flag标签序列不是唯一的，有文献直接用3个Flag的串联重复，这不利于标签的去除，常用的序列为序列为DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag可免疫原性和与抗体的亲和性得到极大增强，适用于真核生物低水平表达的蛋白的检测和纯化。目前，市场上已有很多可供选择的商业化Flag及 3×Flag抗体。

5) S

S标签，是一段来源于胰腺核糖核酸酶 A（RNase A）N 末端的短肽，氨基酸序列为KETAAAKFERQHMDS。 通常将 S-tag 构建到目标蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商业化的 S-tag 抗体进行免疫检测。此外，S-tag与S-蛋白质（同样来自于RNase A）之间有强烈相互作用，因此S-tag可用于蛋白质纯化，但由于洗脱条件较苛刻，为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签，然后洗脱目标蛋白。

6) T7

T7标签，一种源自T7噬菌体衣壳蛋白的表位标签，序列为MASMTGGQQMG，可融合到目标蛋白质的N或C末端，可购买商业化的Anti－T7抗体检测。T7标签常用于蛋白质印迹实验。

7) V5

V5标签，是猿猴病毒5（SV5）副粘病毒P和V蛋白上存在的小表位（Pk）短肽，序列为RNA聚合酶α亚基的95-108位氨基酸残基GKPIPNPLLGLDST，可被融合到目标蛋白的N或C末端。在文献报道中，大多将V5融合到目标蛋白C端，常用于哺乳动物和昆虫细胞表达系统蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀检测。

蛋白质纯化的方法有很多，离子交换、疏水层析、分子筛和亲和层析，其中纯化效果最好的无疑是亲和层析，它利用基质与蛋白标签间的特异性结合，以极高的得率和纯度获得目标蛋白。下面就挑几个常用的纯化标签来介绍一下。

1) His

His标签，大多是指六个组氨酸组成的融合标签，即His6，可融合在目的蛋白的C末端或N末端。His标签在蛋白质纯化领域可谓是“最靓的仔”，1987年，Hochuli等首次提出利用组氨酸标签纯化蛋白质，至今His标签在蛋白质纯化领域仍有最广泛的应用。组氨酸残基侧链与固定的镍离子有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)。标签的分子量小，只有约0.84KD，一般不影响目标蛋白的功能，此外His标签也可用于免疫检测，而融合His标签的蛋白免疫原性较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

2) GST

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，GST是大标签，它是一个完整的蛋白质，分子量约26KD。GST一方面具有高度可溶性，能够增加目标蛋白的可溶性；另一方面它可以在大肠杆菌中大量表达，提高目标蛋白的表达量。因此被广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。GST标签融合蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶的亲和树脂进行纯化，用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱，可得到高浓度、高纯度融合蛋白。不过由于GST标签较大，通常需要将该标签切除，因此GST一般融合在靶标的N端。对于目标蛋白为活性酶的情况，如果经过活性验证确认GST对酶的活性没有影响，也可以保留标签。目前，也有很多商业化的GST抗体可用于对目的蛋白进行用特异性检测。

3) MBP

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签，是蛋白质纯化最常用的标签之一，也是大标签，分子量大小在40kDa以上，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加目标蛋白在细菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表达量。MBP可以和交联淀粉亲和树脂结合，结合的融合蛋白可用10-20mM麦芽糖在温和条件下洗脱，得到高纯度、高浓度目标蛋白。MBP的特点与使用方法与GST十分相似，也有专门的商品化抗体进行检测。需要注意的是，MBP序列有两种形式，一种N端含有信号肽，适用于毒性蛋白的表达纯化，一般融合在N端；一种不含信号肽序列，可融合在N端或C端，多融合在N端。

4) CBD

CBD标签，一般是指来源于枯草杆菌的几丁质结合结构域，分子量约5kDa，该标签由NEB公司推出，结合其IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统，用于（毒性）目标蛋白的表达与纯化。在IMPACT系统中，CBD和一个来源于酵母的intein蛋白质组成一个双效的融合标签。Intein是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子，intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。也就是说融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4℃）条件下用含DTT，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将融合标签留在纯化柱上，而还原剂的小分子可以非常简单的去除。后来NEB推出了IMPACT-CN系统（即融合标签可以选择在目的蛋白的C端或者N端）和更加灵活便利的IMPACT—TWIN系统，感兴趣的可以自己去了解下。
（我使用过该系统，但效果并不像宣传的那么理想，原因有两个：1）因为要使用DTT作为切割剂，不适合含有内部二硫键蛋白质的纯化 2）融合基因在体内体外均存在较大的自剪切风险，在纯化毒性较大的蛋白质时，很难得到目标蛋白。）

5) Strep-tag

Strep标签，一般指Strep-tag II，是长度8个氨基酸的短肽，序列为WSHPQFEK，可以融合在目标蛋白N端或C端。Strep标签融合蛋白与链霉菌抗生物素蛋白柱上的基质特异性结合，D-生物素或其衍生物可作为洗脱剂，从而实现融合蛋白的特异性纯化。由于，抗体柱十分昂贵，Strep标签在蛋白纯化中并不常用。

6) Halo-Tag

Halo标签，是一种细菌脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的Halo-Tag配基有效地共价结合，分子量为33KDa，可融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

7) SNAP-tag

SNAP-标签，是一种人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的突变体，长度为182个氨基酸，分子量约19 kDa，可与任何目标蛋白质融合，并进一步用合适的配体（例如荧光染料）进行特异性和共价标记。将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

8) SUMO

SUMO标签，是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），在一级结构上与泛素只有18%的同源性，但两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现，SUMO可以作为融合标签，不但可以提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进目标蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。此外，使用SUMO蛋白水解酶，能识别完整的SUMO标签，并高效的把SUMO从融合蛋白上切割下来。该标签主要用于改善目标蛋白的表达，并非常用的纯化标签，要用于纯化可采用双标签。

9) NusA、TrxA、DsbA

NusA标签是一种反转录终止因子，能增加融合蛋白的溶解度和表达；TrxA标签是硫氧还蛋白，几乎存在于所有生物中，它即可能会增加融合蛋白的溶解度，方便地纯化细菌粗周质提取物，也有助于外源基因形成二硫键；DsbA标签是蛋白质二硫键异构酶，能够增加目标蛋白溶解度，有助于形成二硫键。

这三种标签，主要用于改善目标蛋白的表达，本身不用于纯化，必须与另一个亲和标签联用方可实现蛋白质纯化。而且这三种标签均具有细胞周质定位作用，因此一般融合在目标蛋白N端。这三个都属于大标签，可能会影响融合蛋白的性质，一般来说纯化后需要去除。

示踪标签主要是指利用标签本身的荧光或者催化底物发射荧光或者可见光，来检测目标蛋白在生物体内定位、转移、互作的情况。示踪标签一般分子量较大，需要在标签与目标蛋白之间加Linker序列，避免两个蛋白相互影响各自的功能。示踪标签可与检测标签联用，用于目标蛋白的检测分析，也可与纯化标签联用用于后继纯化。

1) GFP、EGFP、YFP

GFP（Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）标签含有 238 个氨基酸，分子量约为 26.9 KDa，在维多利亚多管发光水母中发现的，在紫外线的照射下会发出绿色的荧光的蛋白，与靶蛋白融合后不会显著地影响天然蛋白质的组装和功能。EGFP 标签是增强型绿色荧光蛋白，与 GFP 相比，具有更高的折叠效率（由于正确折叠的蛋白质比例更高而增加的荧光），荧光强度更强、荧光性质更稳定。YFP（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）标签，可以看做绿色荧光蛋白的一种突变体，其荧光向红色光谱偏移。这些标签与目标蛋白融合后，可以通过激光共聚焦显微镜，观察融合蛋白在生物体内的情况，常用于亚细胞定位、荧光共定位分析、在体荧光成像等实验。示踪标签可以加在目标蛋白的N端或C端，这个要视具体的情况而定，比如细胞定位示踪，如果定位序列位于目标蛋白N端，标签就要加在C端；如果定位序列位于C端，标签就要加在N；如果定位序列位于中间，可以加在N端或C端。

2) 萤光素酶

萤光素酶（Luciferase，Luc）常作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶，他们可以催化荧光素底物发射荧光，作为示踪标签常用于活体成像、药物分析等领域。携带荧光素酶标签（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素底物，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

3) Gus

Gus标签，是细菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase），能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因。用作融合标签时，gus标签可放在目标蛋白的N端或C端，所产生的融合蛋白一般仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件。

当然不是，几乎任何标签都可以作为检测标签。不过上面这些标签应用比较广泛，检测灵敏度较高，对应抗体、试剂等也比较成熟，是最为常用的检测标签，在加检测标签时，可以作为首选。

当然也不是，检测标签、纯化标签、示踪标签，在功能上没有绝对的界限，所有的检测标签也可以用于纯化，只不过需要先制备对应的抗体固定到纯化基质上，比如S标签需要S蛋白固定到纯化树脂上，这就需要购买专门的纯化柱料，十分昂贵。当然也可以采取通用的做法，比如通过protein A吸附抗体，再利用抗体吸附融合的目标蛋白，但是这样做纯化效率可能不太高，吸附能力也有限，而且成本较高（protein A柱料的价格是Ni-NTA柱料的5-10倍），虽然这种方法可以得到极高的纯度，但并没有被普遍采用。

标签选好了，那到底是该加在N端还是C端呢？在较多的报道中，标签一般加在目标蛋白的C端，因为蛋白质折叠是从N端开始的，加在N端有被目标蛋白包埋的风险。但是，目前没有统一的标准，要具体情况具体分析，最好参阅相关文献。

一般检测标签都是小标签，对目标蛋白的功能与结构影响不大，N端C端皆可。需要注意的是采用双标签的情况，如果是两个小标签，那就一边一个，一般不建议串联两个不同的标签，比如一个3×Flag检测标签，一个His纯化标签，那就应该把3×Flag放在N端，His放在C端，因为纯化之后大概率需要切除3×Flag，如果两者交换位置就无法实现这样的目的。

His标签是应用最广泛的标签，既可以用于纯化也可以用于检测，而且大多数情况不需要切除，加在N端存在提前终止翻译和无法终止翻译的可能，产生的副产物不利于分离纯化；加C端时存在次级翻译起始的可能，产生的副产物也不利于分离纯化，双端His有利于目标蛋白的准确检测与纯化，但可能影响酶的活性。

纯化标签分子量较大，多数情况下要被切除，因此一般放在目标蛋白N端，检测标签放在C端，如过必需将大的纯化标签放在C端，检测标签可放在目标蛋白N端或者融合蛋白C端。但检测标签不能放在目标蛋白与纯化标签之间。

对于GFP标签，大多用于目标蛋白的细胞定位，应此标签的位置就由定位序列位置决定，定位序列在C端，GFP就应该放在N端，检测标签应该放在GFP的N端；反之，GFP应放在C端，检测标签放在GFP的C端。

当融合标签对目标蛋白的功能与结构没有影响时，不需要切除融合标签，这不是只针对小标签，大标签如GST、MBP等也是如此，NEB公司纯化的一些核酸工具酶就是融合了MBP标签的，我曾融合表达了MBP-APOBEC3A，MBP并不影响APOBEC3A的C→T活性，基因编辑技术中的AE和CE点编辑系统，就是基于Cas蛋白与APOBEC蛋白各自的功能实现的。两者分子大小相差极大但功能互不影响，就是因为各自的功能结构域折叠比较稳定，且无蛋白质间相互作用。如果融合标签与目标蛋白也满足这种关系，基本是不用去除标签的，不过这种影响是不可预料的，可以参考相关文献或者做预实验确定。
常用的去除蛋白标签的蛋白酶，及其识别序列如下表。

[1] Protein tag[维基网络], https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tag
[2] Kimple M E, Brill A L, Pasker R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current protocols in protein science, 2013, 73(1): 9.9. 1-9.9. 23.
[3] Marintcheva, B. Viral Tools for Protein Expression and Purification. Harnessing the Power of Viruses, 2018, 103–131.
[4] Terpe, K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60: 523–33.
[5] Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif., 1997, 11: 1–16.
[6] Malhotra A. Tagging for protein expression[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 2009, 463: 239-258.

『柒』 质粒图谱怎么看

1.第一步，看箭头：

大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。

还需要提到的是F1启动子（图上的f1 ori）代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA哦，但是可以用来测序。看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。

2.第二步，看上面的标签。

报告基因：通常会有一两个蛋白，被用作报告基因，比如常见的copGFP（绿色荧光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操纵子）等等。和抗性基因不同，这样的报告基因，并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。

而是在质粒转入表达体系后起到作用的，基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达，有的会另外用一个独立的启动子进行表达（比如shRNA的质粒中）。

3.第三步，看多克隆位点：

MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位点），一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序，一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的，需要注意的是这样几点。

第一点是要注意，酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。

第二点需要注意的是，有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC无法切开]，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。

4.第四步，看多克隆位点的序列：

末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的话，插入片段是允许有3`末端的冗余。

为了可以应付3`末端的冗余碱基，在多克隆位点序列后，会有译码的终止TAA密码，即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变，照样能使表达的蛋白正常终止掉（在酵母双杂的AD质粒中，由于插入的是随机cDNA，所以AD的载体上会常见这样的结构）。

(7)trxtag标签作用扩展阅读

分类

1.根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。

接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。

2.根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。

严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。

松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。

3.根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。

不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。