trx標簽是his嗎

1. 蛋白質融合標簽

蛋白標簽（Protein tag）技術是指利用基因克隆手段，將具有特定功能的多肽，蛋白質結構域，甚至完整蛋白質與目標蛋白融合在一起，以實現目標蛋白的表達純化，檢測和示蹤等應用的技術。蛋白標簽融合已經成為蛋白質研究中最常用的技術之一，下面我就為大家盤一盤這些常用標簽的特點及應用。

蛋白標簽根據其功能，大致可以分為檢測標簽、表達純化標簽和示蹤標簽三類。

蛋白質的檢測方法包括質譜、酶活檢測、免疫分析等，其中應用最為廣泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要將目標蛋白作為抗原，注射動物，然後從免疫血清中分離抗體，根據抗原-抗體間的免疫反應進行特異性檢測。這種方法最大的缺陷就是每更換一個目標蛋白就要制備一個對應的抗體，操作繁瑣，成本昂貴。融合標簽的使用，使蛋白質免疫分析走向通用化和便利化。我們將特定的標簽與目標蛋白融合後，兩者是共同表達的，通過檢測融合標簽，可以得到目標蛋白的表達情況。經過長期的研究，目前已經開發出一些比較成熟的檢測標簽，下面就挑幾個來介紹一下：

1) HA

HA標簽，屬於小標簽，共9個氨基酸，標簽序列YPYDVPDYA，源於流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，對目標蛋白的空間結構影響小, 可融合到N端或者C端，可購買商業化的Anti－HA抗體檢測。HA標簽常用於蛋白質印跡，免疫熒光和免疫沉澱實驗，偶爾用於ELISA和ChIP分析。

2) His

His標簽，也是小標簽，多指6個組氨酸多肽，該標簽對目標蛋白的空間結構影響極小, 可融合到N端或者C端，一般無需切除也不會對目標蛋白功能產生影響，可購買商業化的Anti－His抗體檢測。His標簽常用於蛋白質印跡實驗。

3) c-Myc

Myc標簽，包含人類原癌基因Myc的10個氨基酸區段，序列為EQKLISEEDL，可融合到目標蛋白N端或者C端。由於可獲得高特異性抗Myc單克隆抗體，因此在Western印跡，免疫熒光和免疫沉澱實驗中被廣泛使用，但是很少用於蛋白質純化。目前，市場上已有很多可供選擇的商業化c-Myc抗體。

4) Flag, 3×Flag

FLAG標簽，是目標蛋白中一種比較流行的短肽標簽，序列為DYKDDDDK，可以與蛋白質的C端或N端融合。由於其包含腸激酶的識別位點（DDDDK），可方便去除，因此比較適合融合在目標蛋白N端。Flag標簽與同類標簽相比，更具親水性，因此通常不會變性或使與其連接的蛋白質失活，常用於真核表達系統中目標蛋白的檢測。目前已經開發出性能更好的3×Flag 標簽，共22個氨基酸，分子量2.7KDa。3×Flag標簽序列不是唯一的，有文獻直接用3個Flag的串聯重復，這不利於標簽的去除，常用的序列為序列為DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag可免疫原性和與抗體的親和性得到極大增強，適用於真核生物低水平表達的蛋白的檢測和純化。目前，市場上已有很多可供選擇的商業化Flag及 3×Flag抗體。

5) S

S標簽，是一段來源於胰腺核糖核酸酶 A（RNase A）N 末端的短肽，氨基酸序列為KETAAAKFERQHMDS。 通常將 S-tag 構建到目標蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商業化的 S-tag 抗體進行免疫檢測。此外，S-tag與S-蛋白質（同樣來自於RNase A）之間有強烈相互作用，因此S-tag可用於蛋白質純化，但由於洗脫條件較苛刻，為了獲得有功能的蛋白質推薦用蛋白酶切割標簽，然後洗脫目標蛋白。

6) T7

T7標簽，一種源自T7噬菌體衣殼蛋白的表位標簽，序列為MASMTGGQQMG，可融合到目標蛋白質的N或C末端，可購買商業化的Anti－T7抗體檢測。T7標簽常用於蛋白質印跡實驗。

7) V5

V5標簽，是猿猴病毒5（SV5）副粘病毒P和V蛋白上存在的小表位（Pk）短肽，序列為RNA聚合酶α亞基的95-108位氨基酸殘基GKPIPNPLLGLDST，可被融合到目標蛋白的N或C末端。在文獻報道中，大多將V5融合到目標蛋白C端，常用於哺乳動物和昆蟲細胞表達系統蛋白質印跡，免疫熒光和免疫沉澱檢測。

蛋白質純化的方法有很多，離子交換、疏水層析、分子篩和親和層析，其中純化效果最好的無疑是親和層析，它利用基質與蛋白標簽間的特異性結合，以極高的得率和純度獲得目標蛋白。下面就挑幾個常用的純化標簽來介紹一下。

1) His

His標簽，大多是指六個組氨酸組成的融合標簽，即His6，可融合在目的蛋白的C末端或N末端。His標簽在蛋白質純化領域可謂是「最靚的仔」，1987年，Hochuli等首次提出利用組氨酸標簽純化蛋白質，至今His標簽在蛋白質純化領域仍有最廣泛的應用。組氨酸殘基側鏈與固定的鎳離子有強烈的吸引力，可用於固定化金屬螯合層析(IMAC)。標簽的分子量小，只有約0.84KD，一般不影響目標蛋白的功能，此外His標簽也可用於免疫檢測，而融合His標簽的蛋白免疫原性較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫並制備抗體。

2) GST

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)標簽，是蛋白質純化最常用的標簽之一，GST是大標簽，它是一個完整的蛋白質，分子量約26KD。GST一方面具有高度可溶性，能夠增加目標蛋白的可溶性；另一方面它可以在大腸桿菌中大量表達，提高目標蛋白的表達量。因此被廣泛應用於各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。GST標簽融合蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的親和樹脂進行純化，用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫，可得到高濃度、高純度融合蛋白。不過由於GST標簽較大，通常需要將該標簽切除，因此GST一般融合在靶標的N端。對於目標蛋白為活性酶的情況，如果經過活性驗證確認GST對酶的活性沒有影響，也可以保留標簽。目前，也有很多商業化的GST抗體可用於對目的蛋白進行用特異性檢測。

3) MBP

MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽，是蛋白質純化最常用的標簽之一，也是大標簽，分子量大小在40kDa以上，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加目標蛋白在細菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表達量。MBP可以和交聯澱粉親和樹脂結合，結合的融合蛋白可用10-20mM麥芽糖在溫和條件下洗脫，得到高純度、高濃度目標蛋白。MBP的特點與使用方法與GST十分相似，也有專門的商品化抗體進行檢測。需要注意的是，MBP序列有兩種形式，一種N端含有信號肽，適用於毒性蛋白的表達純化，一般融合在N端；一種不含信號肽序列，可融合在N端或C端，多融合在N端。

4) CBD

CBD標簽，一般是指來源於枯草桿菌的幾丁質結合結構域，分子量約5kDa，該標簽由NEB公司推出，結合其IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統，用於（毒性）目標蛋白的表達與純化。在IMPACT系統中，CBD和一個來源於酵母的intein蛋白質組成一個雙效的融合標簽。Intein是一個蛋白質剪接元件，類似於基因組中的內含子，intein在較低的溫度和還原條件下發生自身介導的N端裂解，可以釋放出與之相連的目的蛋白。也就是說融合表達產物在掛上親和層析柱後只需要在低溫（4℃）條件下用含DTT，或者巰基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脫，即可將目的蛋白洗脫，而將融合標簽留在純化柱上，而還原劑的小分子可以非常簡單的去除。後來NEB推出了IMPACT-CN系統（即融合標簽可以選擇在目的蛋白的C端或者N端）和更加靈活便利的IMPACT—TWIN系統，感興趣的可以自己去了解下。
（我使用過該系統，但效果並不像宣傳的那麼理想，原因有兩個：1）因為要使用DTT作為切割劑，不適合含有內部二硫鍵蛋白質的純化 2）融合基因在體內體外均存在較大的自剪切風險，在純化毒性較大的蛋白質時，很難得到目標蛋白。）

5) Strep-tag

Strep標簽，一般指Strep-tag II，是長度8個氨基酸的短肽，序列為WSHPQFEK，可以融合在目標蛋白N端或C端。Strep標簽融合蛋白與鏈黴菌抗生物素蛋白柱上的基質特異性結合，D-生物素或其衍生物可作為洗脫劑，從而實現融合蛋白的特異性純化。由於，抗體柱十分昂貴，Strep標簽在蛋白純化中並不常用。

6) Halo-Tag

Halo標簽，是一種細菌脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的Halo-Tag配基有效地共價結合，分子量為33KDa，可融合在重組蛋白的N端或C 端，並在原核和真核系統中表達。

7) SNAP-tag

SNAP-標簽，是一種人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的突變體，長度為182個氨基酸，分子量約19 kDa，可與任何目標蛋白質融合，並進一步用合適的配體（例如熒光染料）進行特異性和共價標記。將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術，不僅專一性極高而且穩定，最大的優點是適用於多種環境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。

8) SUMO

SUMO標簽，是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-like modifier），在一級結構上與泛素只有18%的同源性，但兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現，SUMO可以作為融合標簽，不但可以提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進目標蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。此外，使用SUMO蛋白水解酶，能識別完整的SUMO標簽，並高效的把SUMO從融合蛋白上切割下來。該標簽主要用於改善目標蛋白的表達，並非常用的純化標簽，要用於純化可採用雙標簽。

9) NusA、TrxA、DsbA

NusA標簽是一種反轉錄終止因子，能增加融合蛋白的溶解度和表達；TrxA標簽是硫氧還蛋白，幾乎存在於所有生物中，它即可能會增加融合蛋白的溶解度，方便地純化細菌粗周質提取物，也有助於外源基因形成二硫鍵；DsbA標簽是蛋白質二硫鍵異構酶，能夠增加目標蛋白溶解度，有助於形成二硫鍵。

這三種標簽，主要用於改善目標蛋白的表達，本身不用於純化，必須與另一個親和標簽聯用方可實現蛋白質純化。而且這三種標簽均具有細胞周質定位作用，因此一般融合在目標蛋白N端。這三個都屬於大標簽，可能會影響融合蛋白的性質，一般來說純化後需要去除。

示蹤標簽主要是指利用標簽本身的熒光或者催化底物發射熒光或者可見光，來檢測目標蛋白在生物體內定位、轉移、互作的情況。示蹤標簽一般分子量較大，需要在標簽與目標蛋白之間加Linker序列，避免兩個蛋白相互影響各自的功能。示蹤標簽可與檢測標簽聯用，用於目標蛋白的檢測分析，也可與純化標簽聯用用於後繼純化。

1) GFP、EGFP、YFP

GFP（Green fluorescent protein，綠色熒光蛋白）標簽含有 238 個氨基酸，分子量約為 26.9 KDa，在維多利亞多管發光水母中發現的，在紫外線的照射下會發出綠色的熒光的蛋白，與靶蛋白融合後不會顯著地影響天然蛋白質的組裝和功能。EGFP 標簽是增強型綠色熒光蛋白，與 GFP 相比，具有更高的折疊效率（由於正確折疊的蛋白質比例更高而增加的熒光），熒光強度更強、熒光性質更穩定。YFP（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）標簽，可以看做綠色熒光蛋白的一種突變體，其熒光向紅色光譜偏移。這些標簽與目標蛋白融合後，可以通過激光共聚焦顯微鏡，觀察融合蛋白在生物體內的情況，常用於亞細胞定位、熒光共定位分析、在體熒光成像等實驗。示蹤標簽可以加在目標蛋白的N端或C端，這個要視具體的情況而定，比如細胞定位示蹤，如果定位序列位於目標蛋白N端，標簽就要加在C端；如果定位序列位於C端，標簽就要加在N；如果定位序列位於中間，可以加在N端或C端。

2) 螢光素酶

螢光素酶（Luciferase，Luc）常作為「報告蛋白」被用於分子生物學研究中，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶，他們可以催化熒光素底物發射熒光，作為示蹤標簽常用於活體成像、葯物分析等領域。攜帶熒光素酶標簽（Luc）的質粒轉染入細胞後，導入研究動物如大小鼠體內，之後注入熒光素底物，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或葯物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

3) Gus

Gus標簽，是細菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase），能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質的水解。該酶可將X-Gluc水解生成藍色物質，初始產物並不帶顏色，為無色的吲哚衍生物，後經氧化二聚作用形成5,5』-二溴-4,4』-二氯靛藍染料，此靛藍染料使具有GUS活性的部位或位點呈現藍色，可用肉眼或在顯微鏡下觀察到。因為絕大多數植物細胞內不存在內源的GUS活性，因此gus基因廣泛用作轉基因植物的報告基因。用作融合標簽時，gus標簽可放在目標蛋白的N端或C端，所產生的融合蛋白一般仍具有GUS活性，這對研究外源基因表達的具體細胞部位提供了方便條件。

當然不是，幾乎任何標簽都可以作為檢測標簽。不過上面這些標簽應用比較廣泛，檢測靈敏度較高，對應抗體、試劑等也比較成熟，是最為常用的檢測標簽，在加檢測標簽時，可以作為首選。

當然也不是，檢測標簽、純化標簽、示蹤標簽，在功能上沒有絕對的界限，所有的檢測標簽也可以用於純化，只不過需要先制備對應的抗體固定到純化基質上，比如S標簽需要S蛋白固定到純化樹脂上，這就需要購買專門的純化柱料，十分昂貴。當然也可以採取通用的做法，比如通過protein A吸附抗體，再利用抗體吸附融合的目標蛋白，但是這樣做純化效率可能不太高，吸附能力也有限，而且成本較高（protein A柱料的價格是Ni-NTA柱料的5-10倍），雖然這種方法可以得到極高的純度，但並沒有被普遍採用。

標簽選好了，那到底是該加在N端還是C端呢？在較多的報道中，標簽一般加在目標蛋白的C端，因為蛋白質折疊是從N端開始的，加在N端有被目標蛋白包埋的風險。但是，目前沒有統一的標准，要具體情況具體分析，最好參閱相關文獻。

一般檢測標簽都是小標簽，對目標蛋白的功能與結構影響不大，N端C端皆可。需要注意的是採用雙標簽的情況，如果是兩個小標簽，那就一邊一個，一般不建議串聯兩個不同的標簽，比如一個3×Flag檢測標簽，一個His純化標簽，那就應該把3×Flag放在N端，His放在C端，因為純化之後大概率需要切除3×Flag，如果兩者交換位置就無法實現這樣的目的。

His標簽是應用最廣泛的標簽，既可以用於純化也可以用於檢測，而且大多數情況不需要切除，加在N端存在提前終止翻譯和無法終止翻譯的可能，產生的副產物不利於分離純化；加C端時存在次級翻譯起始的可能，產生的副產物也不利於分離純化，雙端His有利於目標蛋白的准確檢測與純化，但可能影響酶的活性。

純化標簽分子量較大，多數情況下要被切除，因此一般放在目標蛋白N端，檢測標簽放在C端，如過必需將大的純化標簽放在C端，檢測標簽可放在目標蛋白N端或者融合蛋白C端。但檢測標簽不能放在目標蛋白與純化標簽之間。

對於GFP標簽，大多用於目標蛋白的細胞定位，應此標簽的位置就由定位序列位置決定，定位序列在C端，GFP就應該放在N端，檢測標簽應該放在GFP的N端；反之，GFP應放在C端，檢測標簽放在GFP的C端。

當融合標簽對目標蛋白的功能與結構沒有影響時，不需要切除融合標簽，這不是只針對小標簽，大標簽如GST、MBP等也是如此，NEB公司純化的一些核酸工具酶就是融合了MBP標簽的，我曾融合表達了MBP-APOBEC3A，MBP並不影響APOBEC3A的C→T活性，基因編輯技術中的AE和CE點編輯系統，就是基於Cas蛋白與APOBEC蛋白各自的功能實現的。兩者分子大小相差極大但功能互不影響，就是因為各自的功能結構域折疊比較穩定，且無蛋白質間相互作用。如果融合標簽與目標蛋白也滿足這種關系，基本是不用去除標簽的，不過這種影響是不可預料的，可以參考相關文獻或者做預實驗確定。
常用的去除蛋白標簽的蛋白酶，及其識別序列如下表。

[1] Protein tag[維基網路], https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tag
[2] Kimple M E, Brill A L, Pasker R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current protocols in protein science, 2013, 73(1): 9.9. 1-9.9. 23.
[3] Marintcheva, B. Viral Tools for Protein Expression and Purification. Harnessing the Power of Viruses, 2018, 103–131.
[4] Terpe, K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60: 523–33.
[5] Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif., 1997, 11: 1–16.
[6] Malhotra A. Tagging for protein expression[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 2009, 463: 239-258.

2. 6×his標簽結合蛋白分離純化時用不用切掉

分離純化時是否需要切除his標簽要看標簽是否會影響到蛋白的活性。一般情況下6xhis是一個非常小的標簽，不會對蛋白整體的結構和活性有太大影響，如果是加了Trx的His標簽可能會需要切除掉。

3. 質粒圖譜怎麼看

1.第一步，看箭頭：

大多數質粒都會有箭頭，箭頭有兩種解釋。一種是轉錄方向，轉錄方向主要是由啟動子開始的一個大箭頭，是啟動子啟動序列的順序。另一種是復制起始位點的方向，復制起始位點就是該質粒在大腸桿菌等細菌或真菌中DNA復制的一個方向。

還需要提到的是F1啟動子（圖上的f1 ori）代表的是噬菌體的復制起始方向，只能復制出單鏈的DNA哦，但是可以用來測序。看懂轉錄的方向，這樣就方便設計插入片段的位置和方向性。

2.第二步，看上面的標簽。

報告基因：通常會有一兩個蛋白，被用作報告基因，比如常見的copGFP（綠色熒光蛋白），Puro（嘌呤黴素），Lacz（乳糖操縱子）等等。和抗性基因不同，這樣的報告基因，並不是為了在大腸桿菌擴增質粒的過程中起作用的。

而是在質粒轉入表達體系後起到作用的，基本上就是為了顯示過表達或是敲減的基因是否正常運作。有的報告基因會融合在蛋白中表達，有的會另外用一個獨立的啟動子進行表達（比如shRNA的質粒中）。

3.第三步，看多克隆位點：

MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位點），一般圖中會把多克隆位點上的酶切位點都標記出來。上面的酶切位點順序，一般都是按照5`-3`的順序排列下來的，需要注意的是這樣幾點。

第一點是要注意，酶切位點邊標注了*的一般是指並不僅僅存在一個位點，也就不能用來作為構建質粒的酶切位點。

第二點需要注意的是，有的酶切位點，在序列中只有一個，但它上面也會標注一個*或者（dam），這說明可能這個酶切位點會有CpG島的甲基化修飾[常見的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC無法切開]，一般也是不能用的。但是非要用這個酶切位點的話，就需要用非甲基化的感受態細胞，如JM109或者JM110。

4.第四步，看多克隆位點的序列：

末端如果有差異的話，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替換1-2個鹼基（變成GTG或者GCG這樣），從第二個氨基酸序列開始完全一致即可。而配合擴增和酶切的話，插入片段是允許有3`末端的冗餘。

為了可以應付3`末端的冗餘鹼基，在多克隆位點序列後，會有解碼的終止TAA密碼，即使插入的片段使得3`末端產生了移碼突變，照樣能使表達的蛋白正常終止掉（在酵母雙雜的AD質粒中，由於插入的是隨機cDNA，所以AD的載體上會常見這樣的結構）。

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分類

1.根據質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。

接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。

2.根據質粒在細菌內的復制類型可分為兩類：嚴緊控制型和鬆弛控制型。

嚴緊控制復制型質粒的復制酶系與染色體DNA復制共用，只能在細胞周期的一定階段進行復制，當細胞染色體停止復制時，質粒也就不再復制。

鬆弛控制復制型的質粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響，在整個細胞生長周期中隨時都可以復制，在染色體復制已經停止時質粒仍能繼續復制。

3.根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。

不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存於同一宿主細菌內的現象，反之為相容性。常用於流行病學的調查。

4. pet32a切除標簽

這個我剛好做過，用腸激酶切除~~用Ni-NTA鎳柱純化，你給我個郵箱，方法我發給你

5. 如何閱讀質粒圖譜檔 詳細�0�3

一、一個合格質粒的組成要素 復制起始位點Ori，即控制復制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA 分子有多個復制起始位點。 抗生素抗性基因：可以便於加以檢測，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位點：MCS 克隆攜帶外源基因片段 P/E：啟動子/增強子 Terms：終止信號 加poly（A）信號：可以起到穩定mRNA 作用 二、如何閱讀質粒圖譜 第一步：首先看Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒） Ori 的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向（正向）。 第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什麼篩選標記： （1）Ampr：水解β -內醯胺環，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四環素進入細胞。 （3）camr：生成氯黴素羥乙醯基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那黴素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮黴素β 失活。 第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點，便於外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便於篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小於10Kb 的外源DNA 片段。一般來說，外源DNA 片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。 第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為准繩。 相關概念： 啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號 啟動子－促進DNA 轉錄的DNA 順序，這個DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA 分子上可以與RNApol 特異性結合並使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。 增強子/沉默子－為真核 l 基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。沉默子－負增強子，負調控序列。 核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對於原核而言是AUG（起始密碼）和SD 序列。 l 轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最後一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這2部分共同構成 poly （A）加尾信號。結構基因的最後一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－ stream 有一段GT 或T 富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。 三、載體及其分類 載體：即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。 P.S.基因工程所用的vector 實際上是DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。 載體的分類 按功能分成：（1）克隆載體：都有一個鬆弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA 片段（基因）的載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹型載體）（2）表達載體：具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA 順序的載體。 按進入受體細胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）。 P.S. 穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。 基因工程載體的3個特點： （一）都能獨立自主的復制：載體DNA 分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如 MCS，插在其中的外源DNA 片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。 （二）都能便利的加以檢測： 如載體的葯物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。 （三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。 四、載體的選擇和制備 選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。 載體選擇主要考慮下述3點： 1、 構建DNA 重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。 2、載體的類型： （1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如小於10kb 選質粒。 （2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。 （3）對原核表達載體應該注意3點： ①選擇合適的啟動子及相應的受體菌； ②用於表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位； ③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。 3、載體 MCS 中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易於鏈接，不產生閱讀框架錯位。選用質粒（最常用）做載體的4點要求： ①選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌裡面拷貝數也多（也有大載體）； ②一般使用鬆弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒小於10個。 ③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的餘地； ④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。 無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然後採用適當的限制酶將載體DNA 進行切 割，獲得分子，以便於與目的基因片段進行連接。 二、pET32a(+)自身載體表達的片段大小 The expected fusion protein expressed encoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 20.4 kDa. The Trx-tag by itself would contribute 12kDa. The rest is e to the two His-tags (0.8kDa each) and the S-tag (1.7kDa). The remaining 5.1kDa is e to the intervening（?） 54 amino acids between the tags and until the stop codon. 三、pET32系列載體的載體序列地址 四、pET 系列載體閱讀方法 ori 是復制起始點，細的黑箭頭是幾個不同的轉錄區，其箭頭方向不同，說明每個表達產物（如kan 抗性基因、LacI 等）都有獨立的promoter，有時與T7 promoter 方向相反。粗的黑箭頭是MCS，用於目的基因的插入，箭頭方向表明目的基因的轉錄方向，它的轉錄方向可以與其它幾個不同的轉錄區相同，也可以不同，如 Kan 抗性基因、LacI 的方向是一樣的，可能與調控相關，不同的載體是不一樣的。一個載體可只看它的啟動子到終止子那一段，其它的可以考慮少些。 五、pET 表達菌株的相關信息 （ DE3 ）指宿主為 λ DE3 溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由 lacUV5 啟動子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。這類菌株適用於從克隆到 pET 載體的目標基因生產蛋白。命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 溶菌酶（為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性質粒。帶有 pLysS 的細胞產生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產生更大量酶。這些菌株用於在誘導前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達，這樣可以穩定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的 pET 重組體。帶有 pLacI 的宿主菌產生額外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 載體基礎表達的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化試劑盒用於制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。 AD494 菌株為硫氧還蛋白還原酶 ( trxB ) 突變菌株，能夠在胞漿內形成二硫鍵，提供了生產正確折迭的活性蛋白的潛力。 TrxB 突變可用卡那黴素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的質粒。 B834 為 BL21 的親本菌株。這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記，從而用於結晶學研究。 BL21 應用最廣的宿主菌來源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的優點。 BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 。由於 trxB 宿主有利於胞漿內二硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。 TrxB 突變可用卡那黴素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的質粒。 BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質粒單體產量，有助於穩定含有重復序列或其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的目標質粒。 HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突變。與 BLR 一樣，這些菌株能夠穩定其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。 NovaBlue 適合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉化效率、藍 / 白斑篩選能力（與合適質粒）和導致優質質粒 DNA 高產的 recA endA 突變。由於存在 F 附加體編碼的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴緊型宿主菌。 Origami 為 K-12 衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 和谷胱甘肽還原酶 ( gor ) 基因均為突變，能夠大大增強胞漿內二硫鍵的形成。研究表明即使總體表達水平相似， Origami （ DE3 ）表達的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌與氨苄抗性質粒相容，可用於 pET-32 載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內形成二硫鍵。 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那黴素和四環素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的 pET 質粒。 Origami B 宿主菌來源於 BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突變。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的優點於一體。 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那黴素和四環素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的 pET 質粒。 Rosetta 宿主菌從 BL21 衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性氯黴素抗性質粒補充密碼子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。這樣 Rosetta 菌株提供了「萬能」的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制。 tRNA 基因由它們的天然啟動子驅動。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在於分別帶有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一質粒上。 Tuner 菌株為 BL21 的 lacZY 缺失突變株，能夠調整培養物中所有細胞的蛋白表達水平。 lac 通透酶（ lacY ）突變使得 IPTG 均勻進入群體所有細胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導表達。通過調整 IPTG 濃度，表達可從極低水平調節到極強、完全誘導的表達水平（通常與 pET 載體相關）。低水平表達有時可能增強難表達蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株與 pETBlue 和 pTriEx 載體的表達相容。 詳情可咨詢生物淘

6. 重組蛋白的組氨酸標簽 怎麼去掉

6xHis標簽可用一些酶，譬如TAGZyme去除

7. pet-32a空載體是可溶性表達嗎

該空載體緊緊會表達一段Trx標簽蛋白，加上his標簽，約20kd左右，是高度可溶的。

8. 用pET-32a表達含起始密碼子的目的蛋白時，翻譯是從載體上的起始密碼子開始還是從目的蛋白上的開始

當然是從載體上已有的融合蛋白開始，你的目的蛋白是在Trx和His-tag後面的

9. TRX標簽蛋白怎麼純化

一般這個載體中都會有His 標簽，直接用鎳柱純化即可